Gardnerella vaginalis / Candida albicans – 2 investigații

(sânge periferic, sânge ombilical, lichid amniotic, LCR)

(frotiu genital, sânge periferic, sânge ombilical, urină, salivă, lichid amniotic, LCR, conţinutul leziunilor veziculare)

Informatii generale si recomandari

Virusul Epstein-Barr (EBV) este asociat cu un spectru larg de afectiuni benigne si maligne ce include: mononucleoza infectioasa, limfomul, sindromul limfoproliferativ posttransplant si carcinomul nazofaringian.

Determinarea genomului viral EBV-ADN este din ce in ce mai mult utilizata in laboratoarele clinice in diagnosticul si monitorizarea afectiunilor induse de aceasta infectie⁵.

Infectiile EBV sunt larg raspandite astfel ca pana la virsta de 35-40 ani 95% dintre persoanele  adulte au venit in contact cu acest virus. Multi copii dobandesc infectia in primii de viata, insa in majoritatea cazurilor aceasta este asimptomatica sau evolueaza ca o infectie usoara de tract respirator superior⁷. La adolescent si adultul tanar infectia EBV primara poate determina, in 35-50% din cazuri, mononucleoza infectioasa – o afectiune limfoproliferativa benigna caracterizata prin febra, astenie fizica, faringita si poliadenopatii.

Infectiile primare se caracterizeaza  prin viremii crescute care inregistreaza scaderi pana la valori nedetectabile pe masura ce sistemul imun recunoaste si controleaza infectia. Ca si alte virusuri herpetice, EBV poate sa ramana in organism intr-o stare dormanta ani de zile (infectie latenta). Reactivarile periodice sunt insotite de viremii tranzitorii. Unii pacienti dezvolta ulterior neoplazii asociate infectiei EBV iar acestia prezinta ca trasatura definitorie valori foarte ridicate ale viremiei. Astfel, determinarea cantitativa EBV-ADN nu detecteaza numai infectia activa ci constituie si un fi “marker tumoral” pentru anumite tipuri de procese maligne^2;3;8.

Testul de detectie a genomului EBV (EBV-ADN) in sange poate fi util in diagnosticul mononucleozei infectioase in stadiu precoce precum si in situatiile in care markerii serologici nu ofera rezultate concludente.

Genomul EBV a fost depistat in sangele pacientilor atat in infectiile primare cat si in reactivari. Conform unui studiu, utilizarea metodei moleculare a crescut cu peste 16%  numarul cazurilor diagnosticate⁶.

Complicatiile neurologice in mononucleoza infectioasa au fost documentate pentru prima data in urma cu peste 70 ani. Incidenta exacta a acestora nu este cunoscuta, dar este estimata la 1-5% din cazuri. EBV produce afectiuni atat ale sistemului nervos central cat si periferic. Prezenta EBV-ADN in LCR a fost demonstrata astfel la pacienti cu meningita aseptica, encefalita, mielita si neuropatie (oftalmoplegie, plexopatie lombosacrata, neuropatie senzoriala sau autonoma)¹.

Alaturi de diagnosticul complicatiilor neurologice ale infectiei primare, EBV-ADN in LCR constituie un marker non-invaziv pentru cazurile de limfom al sistemului nervos central asociate cu sindromul imunodeficientei dobandite SIDA (sensibilitate de 83-100% si specificitate >90% ca „marker tumoral”)⁴.

Pregatire pacient – nu este necesara⁵.

Specimen recoltat – a) sange venos; b) lichid cefalorahidian recoltat prin punctie lombara⁵.

Recipient de recoltare – a) vacutainer ce contine EDTA ca anticoagulant; b) recipient steril pentru LCR⁵.

Cantitate recoltata – a) cat permite vacuumul; b) minimum 2 mL⁵.

Prelucrare necesara dupa recoltare – a) proba nu va fi centrifugata⁵.

Cauze de respingere a probei – a) probe vechi, coagulate, hemolizate; folosirea heparinei ca anticoagulant⁵.

Stabilitate proba – probele de sange sau de LCR sunt stabile 3 zile  la 2-8°C⁵. Probele nu se congeleaza!

Metoda – Real-time PCR Light-Cycler: reactie de polimerizare in lant cu detectie in timp real a produsului PCR  acumulat, prin masurarea fluorescentei emise⁵.

Valori de referinta – EBV-ADN nedetectabil⁵.

Limita de detectie – 1.8 UI/µL⁵.

Interpretarea rezultatelor

Obtinerea unui rezultat pozitiv in LCR sustine diagnosticul clinic de afectiune SNC cauzata de EBV⁷.

Limite si interferente

Un rezultat negativ in LCR nu elimina posibilitatea unei infectii SNC cauzata de EBV⁷.

La pacientii cu SIDA pot exista ocazional rezultate fals pozitive sau fals negative pentru EBV-ADN in LCR; in situatiile neconcludente se va recurge la biopsie cerebrala pentru a confirma sau infirma un limfom primar SNC⁴.

Bibliografie

1. Arshad Majid et al. Epstein–Barr virus myeloradiculitis and encephalomyeloradiculitis. In Brain, Vol. 125, No. 1, 159-165, January 1, 2002.

2. De David H. Persing, Thomas F. Smith, Fred C. Tenover. PCR Detection and Typing of Epstein-Barr Virus. In Diagnostic molecular microbiology. 1993. 344-355

3. Gulley ML, Tang W. Laboratory Assays for Epstein-Barr Virus-Related Disease. In J Molec Diagn, 2008; 10:279-292.

4. Guy Boivin. Diagnosis of herpesvirus Infection of the Central Nervous System. In Herpes 11. Supplement 2004; 2, 49-54.

5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2015. Ref Type: Catalog.

6. Luderer Rianne et al. Real Time Epstein-Barr Virus PCR for diagnosis of primary EBV infections and EB reactivation. In Molecular Diagnosis, 2005; 9 ( 4): 195-200.

7. Mayo Clinic/Mayo Medical LaboratoriesTest Catalogs and Guides. Epstein-Barr Virus (EBV) by Rapid PCR. www.mayomedicallaboratories.com. Ref Type: Internet Communication.

8. Ryan JL, Fan H, Swinnen LJ, Schichman SA, Raab-Traub N, Covington M, Elmore S, Gulley ML. Epstein- Barr Virus (EBV) DNA in plasma is not encapsidated in patients with EBV-related malignancies. In Diagn Mol Pathol. 2004;13:61–68.

)

Informaţii generale şi recomandări

Deşi sunt disponibile vaccinuri eficiente încă din 1982, infecţia cu virusul hepatitei B (VHB) continuă să rămână o problemă gravă de sănătate publică. Peste 2 miliarde de persoane din întreaga lume prezintă dovada serologică a infecţiei VHB (în antecedente sau curentă), dintre care aproximativ 257 milioane sunt în stadiul de infecţie cronică (definit prin prezența AgHBs). În 2015 au fost înregistrate 887 000 decese cauzate în principal de complicațiile infecției VHB (ciroza hepatică și carcinomul hepatocelular)¹.

Au fost raportate 9 genotipuri VHB (notate cu majuscule de la A la I) și câteva subgenotipuri, având distribuţii geografice diferite².

Markerii serologici sunt folosiţi adesea ca indicatori de diagnostic şi/sau prognostic ai infecţiei HBV acute sau cronice. Dintre aceştia, AgHBe reprezintă un marker de infecţiozitate şi un indicator al replicării virale active, asociat cu boală hepatică progresivă³. Totuşi, existenţa unor tulpini virale care fie produc AgHBe dar acesta nu este detectabil în ser, fie şi-au pierdut capacitatea de a produce AgHBe chiar în prezenţa unei infecţii active, limitează utilitatea clinică a acestui marker⁴.

Cea mai eficientă şi directă metodă, cu valoare prognostică în evoluţia infecţiilor acute sau cronice, este detectarea cantitativă a ADN-ului VHB din plasmă (viremie B), prin tehnologia PCR. În plus, această metodă permite depistarea ADN-VHB în cazurile de hepatită cronică B cu markeri serologici negativi⁵.

ADN-ul VHB este detectat după aproximativ 30 zile de la contactul infecțios, astfel că poate fi util în în depistarea precoce a infecției acute la unele persoane cu risc crescut, înainte de apariția în ser a AgHBs⁶.

Determinarea viremiei este utilă de asemenea pentru monitorizarea eficienţei terapiei antivirale. Studiile au demonstrat că o scădere rapidă şi susţinută a nivelului ADN-VHB la pacienţii aflaţi sub tratament cu α-interferon pegylat (PegINFα) sau cu analogi nucleozidici/nucleotidici reprezintă un factor predictiv pentru un răspuns terapeutic favorabil. Pe de altă parte, monitorizarea viremiei poate avea valoare predictivă în ceea ce priveşte dezvoltarea rezistenţei la analogi nucleozidici/nucleotidici⁵.

Specimen recoltat – sânge venos⁵.

Recipient de recoltare – vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant⁵.

Cantitate recoltată – cât permite vacuumul⁵.

Cauze de respingere a probei – folosirea heparinei ca anticoagulant⁵.

Prelucrare necesară după recoltare – se separă plasma în maxim 1 zi de la recoltare prin centrifugare la 800-1600 x g timp de 20 de minute la temperatura camerei, apoi se transferă intr-o eprubetă de polipropilen (sunt necesari min. 2mL de plasmă) ⁵.

Stabilitate probă – plasma separată poate fi păstrată timp de 72 de ore la temperatura camerei, 7 zile la 2-8°C sau cel puţin 6 săptămâni congelată la  -80°C. Probele pot fi congelate/decongelate de maximum cinci ori fără pierderea ADN-ului VHB⁵.

Metodă – Real-time PCR (TaqMan): reacţie de polimerizare în lanţ cu detecţie în timp real a produsului PCR  acumulat, prin măsurarea fluorescenţei emise.

Menţiune: procesarea probelor se face automat⁵.

Factor de conversie:  ADN-VHB (UI/mL) x5.82 = ADN-VHB (copii/mL).

Valori de referinţă – ADN-VHB nedetectabil; limita de detecţie a metodei în domeniul de linearitate (măsurabil) este de 10 UI/mL; sensibilitatea analitică: 4.4 UI/mL. Un rezultat «nedetectabil» semnifică faptul că este vorba fie de o viremie foarte scăzută (sub limita de cuantificare), fie de o viremie absentă⁵. Un rezultat ADN-VHB < 20 UI/mL indică o viremie detectabilă, dar sub limita cuantificării (testul poate fi repetat după 1-2 luni în funcție de contextul clinic)^5;6.

Raportarea și interpretarea rezultatelor

Rezultatele viremiei sunt exprimate atât numeric (UI/mL) cât și sub formă logaritmică (log₁₀ UI/mL). O modificare cu 1 log₁₀ UI/mL a viremiei față de nivelul bazal indică o creștere sau o scădere de 10 ori⁵.

Nivelul viremiei poate fi corelat cu markerii serologici, biochimici şi cu rezultatele biopsiei hepatice, pentru a indica faza infecţiei cronice VHB. Recent, European Association for the Study of Liver (EASL) a modificat denumirea fazelor infecției VHB (vezi tabelul de mai jos)⁷:

→ Răspuns virusologic: ADN-VHB nedetectabil
Terapia cu analogi nucleozidici/nucleotidici:Ținta terapiei antivirale este supresia pe termen lung a ADN-VHB.Conform ghidului EASL, răspunsul virusologic este definit în funcție de tipul tratamentului antiviral:

→ Răspuns virusologic parțial: ADN-VHB înregistrează o scădere > 1 log₁₀ UI/mL dar este încă detectabil după 12 luni de tratament (în cazul unui pacient compliant)

→ Lipsa răspunsului primar: ADN-VHB înregistrează o scădere < 1 log₁₀ UI/mL după 3 luni de tratament

→ Reapariţia viremiei („breakthrough”): ADN-VHB înregistrează o creștere > 1 log₁₀ UI/mL comparativ cu valoarea cea mai scăzută a viremiei obținută în cursul tratamentului

Terapia cu PegINFα:

→ Răspuns virusologic: ADN-VHB < 2000 UI/mL (evaluat la 6 și 12 luni)⁷.

Răspuns virusologic susținut fără tratament: ADN-VHB < 2000 UI/mL menținut cel puțin 12 luni de la încheierea terapiei (cu analogi nucleozidici/nucleotidici sau cu PegINFα).

• Pentru prevenirea infecției perinatale, la pacientele gravide cu infecție VHB și ADN-VHB > 200 000 UI/mL se recomandă inițierea tratamentului antiviral profilactic în săptămânile 24-28 de sarcină și continuarea acestuia în primele 12 săptămâni după naștere⁷.

Limite şi interferenţe: Acest tip de test a fost validat doar pentru plasma recoltată pe EDTA. Analiza altor tipuri de probe poate duce la rezultate fals pozitive sau fals negative. Heparina inhibă metoda PCR⁵.

Bibliografie

1. World Health Organization. Hepatitis B. WHO Fact Sheet (updated April 2017).
2. Kramvis A. Genotypes and genetic variability of hepatitis B virus. Intervirology. 2014;57(3-4):141-50.
3. Niederau C, Heintges T, Lange S, Goldmann G, Niederau CM, Mohr L, Häussinger D. Long-term follow-up of HBeAg-positive patients treated with interferon alfa for chronic hepatitis B. N Engl J

Med. 1996 May 30;334(22):1422-7.

4. Brown JL, Carman WF, Thomas HC. The clinical significance of molecular variation within the hepatitis B virus genome.
5. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2017. Ref TypeCatalog.
6. Mayo Clinic. Mayo Medical Laboratories. Hepatitis B Virus (HBV) DNA Detection and Quantification by Real-Time PCR, Serum. www.myomedicallaboratories.com 2017.
7. European Association for the Study of the Liver. EASL 2017 Clinical Practice Guidelines on the management of hepatitis B virus infection. J Hepatol. 2017 Apr 18. pii: S0168-8278(17)30185-X. doi:

10.1016/j.jhep.2017.03.021. [Epub ahead of print].

(frotiu genital, urină, secret prostatic, secreţii conjunctivale)